TA克隆的定义是什么？

T-A克隆法就是用改良碱裂解法抽提pBluescript SK(+)质粒，用EcoRⅤ将pBluescript SK(+)质粒切成平端，利用Taq DNA聚合酶及dTTP制备pBluescript SK(+) T-A载体. 将β-actin cDNA片段克隆入自制的pBluescript SK(+) T-A载体，经EcoRⅠ及HindⅢ双酶切得到与设定长度一致的β-actin cDNA片段.

对PCR产物进行克隆是分子生物学领域以及基因工程领域里常用的方法. 以前对PCR产物进行克隆实验, 采用的方案有以下几种：一是将PCR产物切成两端平齐的双链DNA，然后克隆到切成平端的质粒载体上, 或在PCR产物的两端加上人工接头(linker)，经限制性内切酶处理后, 克隆到质粒载体的相应位点上；二是在设计PCR引物时, 使PCR引物的5′端含有可切成粘性末端的限制性内切酶酶切位点的识别序列，在PCR反应结束时, 将PCR产物再用相应的限制性内切酶进行处理，以便于克隆到含相应限制性内切酶酶切位点的质粒载体上. 这两种方法虽然有效,但均较繁琐.

本实验的目的在于利用pBluescript SK(+)质粒、Taq DNA聚合酶及dTTP自制T-A克隆载体, 对从RT-PCR中得到的β-actin cDNA片段进行克隆.

1 材料与方法

1.1 试剂

Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoRⅤ、EcoRⅠ、HindⅢ等限制性内切酶及X-gal、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、PCR扩增β-actin片段所用试剂等来自Promega公司,质粒载体用pBluescript SK(+), 来源于中国科学院细胞生物学研究所，琼脂糖由Sigma公司进口分装, 柱离心式胶回收试剂盒来源于Qiagen公司, 扩增β-actin cDNA片段长度为870 bp.

1.2 DH5α感受态大肠杆菌的制备

按Cohen提出的方法〔1〕, 用0.1 mol/L CaCl2制备感受态细菌.

1.3 自制T-A克隆载体的方法

将20 ng pBS质粒转化于自制的DH5α感受态菌, 用改良的碱裂法抽提pBS质粒. 取5 μg pBS质粒,用限制性内切酶EcoRⅤ切成平端后, 再用0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切是否完全(图1),用柱离心式回收试剂进行回收. 在40 μl反应体系中, 加入 1 μg切成平端的pBS质粒, 2U Taq DNA聚合酶, 10×PCR反应缓冲液 4 μl, 10 mmol/L dTTP 4 μl, 75℃水浴2 h, 即成为3′端含单个胸腺嘧啶核苷酸(T)尾的开环T-A克隆载体.1：DNA分子质量标准ⅩⅥ(250 bp ladder, 0.25～3.0 kb);2，3：用EcoRⅤ酶切的pBS质粒；4：没有酶切的pBS质粒.

1.4 β-actin cDNA片段的T-A克隆

取自制的T-A克隆载体20 ng，按插入DNA片段与载体摩尔数之比(3∶1)的比例，在T4 DNA连接酶的作用下,在10～14℃连接48 h,然后转化于自制的DH5α感受态菌,在含X-gal/IPTG的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选并对抽提质粒后进行酶切鉴定.

2 结果和讨论

对β-actin cDNA片段,从用T-A克隆载体进行克隆得到的蓝白斑中挑选1个蓝斑6个白斑,进行质粒提取及酶切鉴定.结果显示,从6个白斑中提取的质粒用限制性内切酶酶切后得到了与设定长度一致的β-actin cDNA片段(图2).

从含X-gal/IPTG的LB固体培养基上的蓝白斑筛选结果可以看到, 用自制T-A克隆载体进行克隆时，蓝斑较少而白斑较多(图3)，且从6个白斑中提取的质粒用限制性内切酶酶切后都含有插入片段，故对β-actin cDNA片段进行T-A克隆是一简便,而效率高的方法.

1：DNA ⅩⅥ(250 bp ladder,0.25～3.0 kb)；2～7：从自制的T-A克隆白斑中抽提的质粒用EcoRⅠ及HindⅢ进行酶切后的结果；8：从克隆的蓝斑中抽提的质粒经EcoRⅠ及HindⅢ酶切后的结果.

T-A克隆的原理是基于Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性的活性, 可将PCR双链产物的每一条链的3′端加入单A核苷酸尾, 在70～75℃时，Taq DNA聚合酶的这种活性尤为显著, 而常规的PCR反应程序最后的步骤均为72℃延伸7～10 min, 故可满足PCR产物3′端为突出的单A核苷酸尾; 另一方面,在仅有适量的dTTP存在的情况下, Taq DNA聚合酶也可将切成平端的质粒的3′端加入单T核苷酸尾, 故用Taq DNA聚合酶也造成了切成平端的pBS质粒3′端产生了突出的单T核苷酸. PCR产物的3′末端单A核苷酸尾与切成平端的pBS质粒的3′末端突出的单T核苷酸实现了T-A互补, 称为T-A克隆, 它实际上是一种粘性末端连接, 因而具有较高的连接效率.

从一些生物工程公司(如美国的Invitrogen公司或Promega公司)可以购到已制备好的T-A克隆载体, 其制备原理与自制T-A克隆载体方法相似〔2,3〕, 但这类载体价格昂贵, 不利于广泛推广, 而且这种载体反复冻溶后连接效率也会降低;另一方面Invitrogen公司等提供的这类载体量较少, 进行大量的PCR产物克隆需用大量的T-A克隆载体,不能满足大量克隆的需要, 而我们自制的T-A克隆载体, 不但应用pBS质粒可行, 应用其他质粒也同样有效, 且操作简便, 可大量制备, 连接效率足以满足进行克隆操作的需要, 故值得推广应用.

另外,我们也将RT-PCR 扩增得到的含有369个bp的β-LH cDNA片段克隆入自制T-A载体，经自动测序证实，插入片段为370 bp（PCR产物3′端加入了一个A），序列全长与设计的PCR产物序列及大小完全一致.

在本实验中, 我们对用RT-PCR扩增的β-actin cDNA片段进行了T-A克隆,对一般的PCR产物应用此方法也同样可行.

作者单位：上海医科大学生理学教研室

基因克隆的方法主要有哪几种，简述各种方法的原理和用途

问题一：如何计算目的基因和载体的摩尔比 如何计算目的基因和载体的摩尔比

2个目的基因如何导入一个载体.

基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具,将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）.

携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后,停留在细胞中进行（自我复制）或整合到细菌拟核DNA中,随着拟核DNA的复制而复制.

载体除了质粒以外,还有噬菌体载体、病毒载体等.

问题二：连接时载体和片段的摩尔比多少合适 跑胶估计就是用你的样品，和DNA marker中已知量的条带的亮度比例，来估算你的样品的DNA样品。这个需要一定的经验。例如一般的1KB ladder，最亮的条带在点样3微升时为50ng，那么你看你的条带的亮度大约是ladder条带亮度的10倍的话，你就知道你点的样大约是500ng了。

比例的话尽量保持在10：1~3：1间，太少会降低连接效率，拿不到克隆，太高浪费，也会造成非预料的连接结果。

明白了么？

问题三：怎样删除镜像文件 10分 可以进到dos状态下删。也可以调出资源管理器。结束无关进程后再删。如果是虚拟光驱里用的镜像文件可以先在虚拟光驱里退出镜像文件后再删。

问题四：连接时候为什么摩尔比要是1：3-1：10之间呢，原理 为了确保每一个载体都能连上一段目的片段，增加阳性率。

问题五：T载体如何制备 用限制性内切酶制备T载体

陆哲明,柯　杨△[北京大学临床肿瘤学院(北京市肿瘤防治研究所)遗传室,北京　100034]

[关键词]T载体;DNA限制酶类;遗传载体;基因扩增[摘　要]

目的:介绍一种制备T载体的方法。方法:用限制性内切酶XcmⅠ酶切,在两端产生T末端,制备的T载体可直接用来克隆用TaqDNA聚合酶产生带A末端的PCR产物。结果:PCR产物直接和T载体连接,用常规氯化钙法制备的感受态菌转化,对转化子提取质粒进行酶切鉴定,证明阳性率达80%。结论:制备T载体过程简单,质量稳定,产量高,并可扩增等优点。

[中图分类号]Q342[文献标识码]A[文章编号]1671 167X(2002)06 0726 03

PCR是目前体外DNA扩增最常用的方法,对PCR产物进行快速有效的克隆是开展下游许多实验所要求的。目前TA克隆是一种快速的,一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的方法。而商品化的TA克隆系统由于售价高,质量批次间不稳定且无法进行循环使用等缺点,在实际应用中,限制了T载体的广泛使用。本文介绍了一种简单、高效,可在普通实验室中制备并可反复扩增的T载体制备方法,并经PCR产物克隆,酶切鉴定,得到了非常理想的结果。

1　材料与方法1

.1　制备SuperpGEM Teasy载体(简称pSP Teasy载体)1

.1.1　制备pSP Teasy环化载体　以线性化的pGEM Teasy载体(Promega为模板,两边设计引物:

F:GAATAAGCTTGTTCCCAGGTCAAGACTGGATCACTAGT

HindⅢXcmⅠG

AATTCGCG

R:GAACAAGCTTATTCCCAGTCTAGACCTGGATCGAATTC

HindⅢXcmⅠC

CGCGGCCGCCA

引物的5′端各插入HindⅢ和XcmⅠ位点,3′端与模板互补,在PfuDNA聚合酶的作用下扩增,扩增产物经HindⅢ酶切后,自身环化,挑选能被HindⅢ酶切的克隆即为阳性克隆,经测序进一步证实。

1.1.2　制备pSP Teasy线性化载体　按照标准酶切体系,用XcmⅠ(NEB)酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,玻璃奶回收,测量吸光度值(D260),调整质量浓度至50mg?L-1,此载体可直接用于克隆。

3　讨论PCR技术是目前体外扩增DNA最常用的方法。有时需得到克隆化的DNA以便于杂交分析、高质量测序及从复杂PCR产物中分离目的片段。常用的方法有非定向克隆和定向克隆。定向克隆需在引物5′端引入限制性内切酶位点,PCR产物经适当内切酶酶切后产生粘端,连接到相应载体。非定向克隆有两种策略,一种是平末端克隆,在klenow和T4DNA聚合酶作用下修平PCR产物末端,但连接效率仅为粘端连接的1/50,且自身环化率高[1];另一种是TA克隆。TA克隆是一种快速的,一步到位的非定向克隆法,可以把PCR产物直接插入到质粒载体。TA克隆系统利用TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性,在扩增DNA3′末端非模板依赖地加上一个核苷酸,通常为腺苷酸[2]。这个3′A突出端被用于把PCR产物插入到插入位点有一个3′T突出端的载体。制备好的载体,其关键部分是带有3′T突出端的线性分子。目前制备3′T载体的方法是先用平末端限制性内切酶(如EcoRⅤ)酶切载体,再用TaqDNA聚合酶在仅有dTTP的情况下,72～75℃反应,在3′末端添加一个T[1,3]。但是,实际反应过程中,由于3′末端加T为非优先聚合核苷酸,仅部......>>

问题六：连接体系中确定的载体与外源基因之间的摩尔比例关系是固定不变的吗？ 连接体系中确定的载体与外源基因之间的摩尔比例关系是固定不变的

可以为研究者提供研究的具体方法；可以为科学的新发现、新发明提供启示和借鉴。因此现代科学研究中尤其需要注重科学方法论的研究和利用，这也就是我们要强调指出的一个问题。 一、科学实验法 科学实验、生产实践和社会实践并称为人类的三大实践活动。实践不仅是理论的源泉，而且也是检验理论正确与否的惟一标准，科学实验就是自然科学理论的源泉和检验标准。特别是现代自然科学研究中，任何新的发现、新的发明、新的理论的提出都必须以能够重现的实验结果为依据，否则就不能被他人所接受，甚至连发表学术论文的可能性都会被取缔。

问题七：负载两种药物，怎么药物负载量计算 一般负载量是按照质量比或者摩尔比算的,就是负载组分数除以总的组分数但也有按照活性组分和载体之比算的愚见……

基因克隆的方法主要有哪几种

选择目的基因,并设计相应引物；

用引物PCR扩增目的基因片段；

选择合适（抗性标记、酶切位点等）的克隆载体（为了保真扩增）,并将PCR片段连接入克隆载体中；（一般用Taq酶的PCR产物在末尾会自带一个A,可在Solution 1作用下与两端各带一个T的线性T载体直接相连）

将连接产物转化入感受态大肠杆菌,使之在含有抗生素的培养基上生长扩增；

从大肠杆菌中提取质粒（即前面的连接产物）,酶切鉴定和测序鉴定均无误后将目的基因片段切下并与新的表达载体连接,然后再次转化入大肠杆菌中扩增,再提质粒,即得到想要的目的基因片段克隆.